Μια ανάλυση BLAST του μπροστινού εκκινητή, του αντίστροφου εκκινητή και του ανιχνευτή φθορισμού που χρησιμοποιήθηκε σε μια δημοσιευμένη ανάλυση RT-qPCR χανταϊού αποκάλυψε επαναλαμβανόμενες ακριβείς αντιστοιχίσεις με ανθρώπινο γονιδιωματικό υλικό, εγείροντας ερωτήματα σχετικά με το εάν τα ανθρώπινα νουκλεϊκά οξέα θα μπορούσαν εύλογα να συμβάλουν στη θετική παραγωγή σήματος PCR του χανταϊού υπό ορισμένες συνθήκες ανάλυσης.

Το BLAST σημαίνει Basic Local Alignment Search Tool, ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος αλγόριθμος βιοπληροφορικής για τη σύγκριση βιολογικών αλληλουχιών.

Σε απλή γλώσσα, τμήματα των γενετικών αλληλουχιών που χρησιμοποιούνται από το τεστ PCR για την υποτιθέμενη ανίχνευση του ιού χανταϊού ταιριάζουν επίσης άμεσα με τις αλληλουχίες ανθρώπινου DNA.

Αυτό σημαίνει ότι τα συστατικά της δοκιμής δεν ήταν αποκλειστικά μοναδικά για τον χανταϊό σε επίπεδο αλληλουχίας.

Τα θετικά αποτελέσματα θα μπορούσαν να υποδηλώνουν την παρουσία ανθρώπινου υλικού, όχι ιογενούς.

Η αποκάλυψη έρχεται καθώς τα κυρίαρχα μέσα ενημέρωσης κρούουν τον κώδωνα του κινδύνου για ένα υποτιθέμενο ξέσπασμα χανταϊού σε κρουαζιερόπλοιο στα ανοιχτά της Δυτικής Αφρικής.

Τα νέα ευρήματα BLAST γίνονται πιο σημαντικά όταν εξετάζονται παράλληλα με το αρχικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ 5,210,015, το οποίο δηλώνει ρητά ότι η συμπληρωματικότητα του ανιχνευτή PCR «δεν χρειάζεται να είναι τέλεια» και ότι ένα ανιχνεύσιμο σήμα μπορεί να προκύψει μέσω «διάσπασης ανεξάρτητης από πολυμερισμό», που σημαίνει ότι η παραγωγή ανιχνεύσιμου σήματος φθορισμού δεν απαιτεί απαραίτητα πλήρη ενίσχυση στόχου.

Με απλούστερους όρους, το αρχικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας πίσω από τη σύγχρονη δοκιμή TaqMan PCR αναγνωρίζει ότι η χημεία μπορεί ακόμα να παράγει ένα ανιχνεύσιμο σήμα ακόμη και όταν η γενετική αντιστοίχιση είναι ατελής και ακόμη και όταν δεν συμβαίνει πλήρης ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου.

Ακόμη και μερική ομοιότητα μεταξύ των συστατικών PCR του χανταϊού και της ανθρώπινης γενετικής θα μπορούσε να οδηγήσει σε θετικό αποτέλεσμα δοκιμής, ακόμη και όταν δεν υπάρχει ιός.

Εκκινητές και ανιχνευτής δοκιμής PCR

Τα συστατικά της ανάλυσης που αναλύθηκαν περιελάμβαναν:

• Εμπρός αστάρι: GCAGCTGTGTCTACATTGGAGAA

• Αντίστροφο αστάρι: TGGTTTTGAAGCCAGTTTTTGA

• Ακολουθία ανιχνευτή: AAACTCGCAGAACTCAAGAGACAGCTGGC

Αποκτήθηκαν από μια μελέτη PLoS Neglected Tropical Diseases τον Δεκέμβριο του 2019.

 

Οι εκκινητές είναι σύντομες γενετικές αλληλουχίες που έχουν σχεδιαστεί για να συνδέονται με μια περιοχή στόχο, ώστε να μπορεί να ξεκινήσει η ενίσχυση.

Ο καθετήρας είναι το εξάρτημα ανίχνευσης φθορισμού που βοηθά στη δημιουργία του «θετικού» σήματος που βλέπει το μηχάνημα.

Η αλληλουχία ανιχνευτή προήλθε από τη δημοσιευμένη ανάλυση μετά την αφαίρεση των ετικετών φθορισμού αναφοράς και χημείας σβέσης (και ) έτσι ώστε να αναλυθεί μόνο η ίδια η αλληλουχία νουκλεοτιδίων.FAMZEN

Το Forward Primer παρήγαγε εκτεταμένες ανθρώπινες αντιστοιχίες

Η ανάλυση BLAST του μπροστινού εκκινητή παρήγαγε πολυάριθμες ακριβείς και σχεδόν ακριβείς αντιστοιχίσεις με το ανθρώπινο γονιδιωματικό υλικό.

Αυτό σημαίνει ότι τμήματα της αλληλουχίας εκκινητή ταιριάζουν άμεσα με αλληλουχίες που υπάρχουν ήδη φυσικά μέσα στο ανθρώπινο γονιδίωμα.

Τα αποτελέσματα περιελάμβαναν:

• επαναλαμβανόμενες 19/19 ακριβείς αντιστοιχίσεις,

• πολλαπλές ακριβείς αντιστοιχίσεις 18/18,

• επαναλαμβανόμενες 17/17 ακριβείς αντιστοιχίσεις,

• και ευρέως διαδεδομένους αγώνες 16/16.

Μια «ακριβής αντιστοίχιση 19/19» σημαίνει 19 διαδοχικά γενετικά γράμματα που ταιριάζουν τέλεια μεταξύ της ζητούμενης αλληλουχίας και του ανθρώπινου DNA.

Η ακολουθία ευθυγραμμίστηκε με:

• Περιοχές που σχετίζονται με το GALNT6,

• περιοχές που συνδέονται με το EPHB2,

• Περιοχές που σχετίζονται με το ZBTB20,

• χρωμόσωμα 1,

• χρωμόσωμα 3,

• περιοχές ενίσχυσης,

• Βιβλιοθήκες κλώνων BAC,

• και πολυάριθμους πρόσθετους ανθρώπινους γονιδιωματικούς τόπους.

Μια ευθυγράμμιση έδειξε:

"Ταυτότητες: 19/19 (100%)"

Ένας άλλος έδειξε:

"Ταυτότητες: 18/18 (100%)"

 

Zpsapszk014 Ευθυγράμμιση

72.1KB ∙ Αρχείο PDF

Λήψη

Ο αντίστροφος εκκινητής ταίριαξε επίσης με το ανθρώπινο DNA σε πολλαπλά χρωμοσώματα

Το αντίστροφο αστάρι παρήγαγε παρόμοιες εκτεταμένες ανθρώπινες ευθυγραμμίσεις.

Με άλλα λόγια, και οι δύο πλευρές του συστήματος ενίσχυσης PCR έδειξαν σημαντική επικάλυψη αλληλουχίας με ανθρώπινο γενετικό υλικό.

Τα αποτελέσματα περιελάμβαναν:

• επαναλαμβανόμενες 20/20 ακριβείς αντιστοιχίσεις,

• πολλαπλές ακριβείς αντιστοιχίσεις 18/18,

• πολυάριθμες 17/17 ακριβείς αντιστοιχίσεις,

• και ευρέως διαδεδομένες ακριβείς αντιστοιχίσεις 16/16.

Μια «ακριβής αντιστοίχιση 20/20» σημαίνει και τα 20 γενετικά γράμματα ευθυγραμμισμένα τέλεια με το ανθρώπινο DNA.

Η ακολουθία ευθυγραμμίστηκε με:

• RBFOX1,

• KCNH5,

• TGFB2,

• DLG2,

• CDH13,

• ΡΟΜΠΟ2,

• PLA2G4A,

• ΜΥΟ5Γ,

• περιοχές βαριάς αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης,

• και πολυάριθμες ανθρώπινες χρωμοσωμικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένων των χρωμοσωμάτων 1, 3, 5, 8, 11, 14, 15, 16, 18, 20, 21, X και Y.

Μια ευθυγράμμιση έδειξε:

"Ταυτότητες: 20/20 (100%)"

Άλλοι έδειξαν:

"Ταυτότητες: 18/18 (100%)"

και:

"Ταυτότητες: 17/17 (100%)"

 

Zpvn2ybt016 Ευθυγράμμιση

77.9KB ∙ Αρχείο PDF

Λήψη

Ο ανιχνευτής ανίχνευσης φθορισμού παρήγαγε επαναλαμβανόμενες ακριβείς ανθρώπινες αντιστοιχίσεις

Τα ισχυρότερα ευρήματα προήλθαν από την ανάλυση BLAST του ίδιου του ανιχνευτή φθορισμού TaqMan - της αλληλουχίας που εμπλέκεται άμεσα στη χημεία ανίχνευσης σήματος.

Αυτό είναι σημαντικό επειδή ο ανιχνευτής είναι το τμήμα που είναι υπεύθυνο για τη δημιουργία του σήματος φθορισμού που η μηχανή PCR ερμηνεύει ως «θετικό».

Ο ανιχνευτής παρήγαγε:

• επαναλαμβανόμενες 18/18 ακριβείς αντιστοιχίσεις,

• πολυάριθμες 17/17 ακριβείς αντιστοιχίσεις,

• επαναλαμβανόμενες 16/16 ακριβείς αντιστοιχίσεις,

• και ευθυγράμμιση 20/21 (95%) με το ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA.

Μια αντιστοίχιση 20/21 σημαίνει 20 από τα 21 γενετικά γράμματα ευθυγραμμισμένα με το ανθρώπινο DNA.

Ο ανιχνευτής ευθυγραμμίστηκε με:

• χρωμόσωμα 1,

• χρωμόσωμα 12,

• χρωμόσωμα 18,

• χρωμόσωμα 19,

• χρωμόσωμα 21,

• TMEM192,

• Παραλλαγές μεταγραφής MGA,

• BCLAF3,

• SESN1,

• Περιοχές ενισχυτή OCT4-NANOG,

• και πολλαπλές ανθρώπινες γονιδιωματικές βιβλιοθήκες BAC και FOSMID.

Μια ευθυγράμμιση έδειξε:

"Ταυτότητες: 18/18 (100%)"

Ένας άλλος έδειξε:

"Ταυτότητες: 17/17 (100%)"

Και ένα άλλο έδειξε:

"Ταυτότητες: 20/21 (95%)"

 

Zpw9kkmt016 Ευθυγράμμιση

70.3KB ∙ Αρχείο PDF

Λήψη

Το πρωτότυπο δίπλωμα ευρεσιτεχνίας TaqMan αναγνωρίζει την ατελή συμπληρωματικότητα

Το αρχικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας TaqMan PCR αναφέρει ρητά:

«Η συμπληρωματικότητα δεν χρειάζεται να είναι τέλεια. Τα σταθερά διπλά μπορεί να περιέχουν αταίριαστα ζεύγη βάσεων ή αταίριαστες βάσεις».

Το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας αναγνωρίζει ότι η χημεία που παράγει θετικά αποτελέσματα μπορεί να λειτουργήσει ακόμα και όταν η γενετική αντιστοίχιση είναι ατελής.

Το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας αναφέρει περαιτέρω:

«Σε αυτή τη διαδικασία, δεν απαιτείται πολυμερισμός για να φέρει την πολυμεράση νουκλεϊκού οξέος στη θέση της για να επιτευχθεί η διάσπαση, επομένως ονομάζουμε αυτή τη διάσπαση ανεξάρτητη από πολυμερισμό».

Αυτό σημαίνει ότι η ανιχνεύσιμη χημεία σήματος μπορεί να συμβεί ακόμη και χωρίς πλήρη ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου.

Και:

«Έτσι, μπορεί να δημιουργηθεί επαρκής ποσότητα επισημασμένων θραυσμάτων, καθιστώντας δυνατή την ανίχνευση απουσία πολυμερισμού».

Αυτό σημαίνει ότι το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας περιγράφει ρητά καταστάσεις όπου μπορεί να συμβεί ανιχνεύσιμο σήμα ακόμη και χωρίς την πλήρη διαδικασία ενίσχυσης που οι άνθρωποι συνήθως συνδέουν με την PCR.

Το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας εξηγεί επίσης:

«Ένα πλεονέκτημα της ανεξάρτητης από τον πολυμερισμό διαδικασίας έγκειται στην εξάλειψη της ανάγκης για ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου».

Η ανιχνεύσιμη παραγωγή σήματος μπορεί να συμβεί χωρίς να χρειάζεται πρώτα να ενισχυθεί πλήρως η πλήρης γενετική αλληλουχία στόχου.

Συμπέρασμα

Τα ευρήματα του BLAST και η γλώσσα του διπλώματος ευρεσιτεχνίας δείχνουν:

• ο μπροστινός εκκινητής μοιράζεται επαναλαμβανόμενες ακριβείς αντιστοιχίσεις με το ανθρώπινο DNA,

• ο αντίστροφος εκκινητής μοιράζεται επαναλαμβανόμενες ακριβείς αντιστοιχίσεις με το ανθρώπινο DNA,

• και ο ίδιος ο ανιχνευτής ανίχνευσης φθορισμού μοιράζεται επαναλαμβανόμενες ακριβείς αντιστοιχίσεις με το ανθρώπινο DNA.

Και τα τρία κύρια συστατικά που εμπλέκονται στο σύστημα ενίσχυσης και ανίχνευσης της ανάλυσης έδειξαν άμεση επικάλυψη αλληλουχίας με ανθρώπινο γενετικό υλικό.

Εν τω μεταξύ, το αρχικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας TaqMan αναγνωρίζει ρητά ότι:

• η συμπληρωματικότητα «δεν χρειάζεται να είναι τέλεια»,

• ανιχνεύσιμο σήμα μπορεί να προκύψει μέσω «διάσπασης ανεξάρτητης από πολυμερισμό»,

• και η ανίχνευση μπορεί να συμβεί «απουσία πολυμερισμού».

Σε συνδυασμό, τα ευρήματα αυξάνουν την πιθανότητα ότι το ίδιο το ανθρώπινο γενετικό υλικό θα μπορούσε εύλογα να συμβάλει στη θετική παραγωγή σήματος PCR του χανταϊού υπό ορισμένες συνθήκες ανάλυσης.

Εάν οι εκκινητές της ανάλυσης και ο ανιχνευτής ανίχνευσης φθορισμού επικαλύπτονται ουσιαστικά με το ανθρώπινο γενετικό υλικό, τότε οι λεγόμενες «περιπτώσεις» του χανταϊού μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν τίποτα περισσότερο από το σύστημα PCR που ανιχνεύει τη γενετική του ίδιου του ασθενούς και όχι έναν πραγματικό ιό.